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楊代常：種出“人血清白蛋白”不是科幻
發(fā)布時(shí)間：2018年12月26日
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跟許多生物醫(yī)藥創(chuàng)新企業(yè)始創(chuàng)人不同，自詡農(nóng)業(yè)出身的禾元生物創(chuàng)始人兼董事長楊代常在超40歲“高齡”才轉(zhuǎn)攻生物制藥方向?；蛟S是這個(gè)緣故，他一出手便埋頭一個(gè)37年前學(xué)界就已提出、但一直未見成熟產(chǎn)品的方向——不依賴血漿、安全、廉價(jià)的重組人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）。
HSA具有多種臨床應(yīng)用價(jià)值，廣泛用于肝硬化腹水、燒傷燙傷、手術(shù)后體液的補(bǔ)充，失血過多導(dǎo)致的休克、腦水腫、癌癥和艾滋病人放化療的輔助治療等。此外，還廣泛用于疫苗賦形劑、蛋白藥物保護(hù)劑以及動(dòng)物細(xì)胞和干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑。
用自己研究多年的水稻作為表達(dá)平臺(tái)，頂著諸多質(zhì)疑與勸阻，在投入研究的10年后，楊代常的夢想——在水稻上種出“人血清白蛋白”的現(xiàn)實(shí)路徑日漸清晰。繼去年拿到全球首個(gè)植物源重組人血清白蛋白注射液臨床批件后，武漢禾元生物以水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)的植物源重組人血清白蛋白（Recombinant Human Serum Albumin from Oryza sativa，OsrHSA)在10月正式啟動(dòng)Ⅰ期臨床。
始于水稻的挑戰(zhàn)
“與基于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的表達(dá)體系相比，水稻種子作為表達(dá)平臺(tái)還有一個(gè)非常大的優(yōu)勢——節(jié)能、環(huán)保、高效和低成本，依靠光合作用即可生產(chǎn)出大量的重組蛋白，擴(kuò)大生產(chǎn)，只要種植就能解決問題了?！?/span>
著手研究前，楊代常對國內(nèi)HAS市場摸了個(gè)底：每年需求量估計(jì)在420 噸左右?？墒茄獫{來源有限又限制了HAS的產(chǎn)能。以國內(nèi)市場為例，中檢院的批簽發(fā)數(shù)據(jù)顯示，去年進(jìn)口人血白蛋白市場占比已超過5成。
“除了血漿短缺原因，尋找非人血來源的重組人血清白蛋白，還可規(guī)避病毒傳染風(fēng)險(xiǎn)，避免血源性疾病。”楊代常解釋，1981年開始，研究者就嘗試在細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞和植物等宿主中采用生物技術(shù)生產(chǎn)重組人血清白蛋白。然而，研究不盡人意，細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞不適于表達(dá)重組人血清白蛋白。
轉(zhuǎn)換思路的楊代常把目光放到了植物。轉(zhuǎn)基因植物很早就被用來開展農(nóng)業(yè)新品種培育和重組蛋白表達(dá)研究，但表達(dá)水平一直是一大瓶頸，同時(shí)下游加工與貯藏也受到時(shí)空限制。據(jù)悉，人血清白蛋白基因由植物表達(dá)是馬鈴薯，然后利用葉綠體表達(dá)體系，但當(dāng)重組蛋白表達(dá)水平高時(shí)，蛋白容易聚集形成類似于細(xì)菌“包涵體”的物質(zhì)，這些不溶的蛋白往往失去了活性，如人血清白蛋白，最終效果不理想。
比較而言，種子表達(dá)體系具有表達(dá)水平高、生產(chǎn)成本低以及加工便利和放大容易等顯著優(yōu)勢，可以說是規(guī)?；a(chǎn)中較成熟的表達(dá)體系?！案硐氲氖?，種子作為植物天然的儲(chǔ)存器，可以在常溫下儲(chǔ)藏4~5年不喪失生物活性?！睏畲Ｕf，同時(shí)種子占用空間小，運(yùn)輸方便，可以很靈活地安排后續(xù)加工。
不過，楊代常選擇水稻胚乳細(xì)胞作為表達(dá)平臺(tái)也不僅僅因?yàn)椤皸l件合適”。作為我國著名遺傳學(xué)家和水稻生物學(xué)家、雜交水稻研究先驅(qū)朱英國院士的“朱門”大弟子，楊代常踏上研究道路的契機(jī)是1975年在一次雜交水稻培訓(xùn)班上與朱英國的首次接觸。
10年后，他在朱英國的幫助和鼓勵(lì)下，以首屆插班生的身份考入武漢大學(xué)，一路成為朱英國的第一個(gè)碩士生、第一個(gè)博士生。畢業(yè)后，楊代常到美國、新加坡和菲律賓等學(xué)習(xí)、工作，成為美國加州一家生物技術(shù)公司的首席科學(xué)家和實(shí)驗(yàn)室主任。2005年，接到朱英國電話后，他毅然放棄美國的一切，回到母校武漢大學(xué)投入研究。
不難看出，水稻，從楊代常起步之初就一直占據(jù)核心位置?！八九呷榧?xì)胞具有完整的真核細(xì)胞蛋白質(zhì)加工體系，重組蛋白質(zhì)的翻譯、折疊和修飾都與哺乳細(xì)胞十分相近?！睏畲Ｕ劦阶罱K決定用水稻種子作為表達(dá)平臺(tái)時(shí)表示。
被注射雜質(zhì)的大鼠
“水稻是我國的主食，已有幾千年的食用歷史，其生物學(xué)背景清楚，目前沒有任何有關(guān)動(dòng)物病原菌和病毒侵入植物細(xì)胞和植物病毒與人共患的報(bào)道，因而利用水稻表達(dá)重組蛋白質(zhì)，完全杜絕動(dòng)物或人類病原菌或病毒的污染，具有更好的安全性。”
作為靜脈注射劑，安全性是OsrHSA最關(guān)鍵的條件。此次開啟臨床試驗(yàn)前，楊代常多次邀請臨床專家一起，反復(fù)討論植物源重組人血清白蛋白注射液Ⅰ期臨床試驗(yàn)方案。
楊代常告訴記者，選擇水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器的另一個(gè)重要原因正是基于人體對大米蛋白質(zhì)有較高耐受性的假設(shè)。比較而言，酵母、細(xì)菌細(xì)胞壁有復(fù)雜的糖結(jié)構(gòu)，人對這類反應(yīng)較敏感。
為了讓人血清白蛋白更適合在水稻種子中合成，楊代常帶領(lǐng)研究團(tuán)隊(duì)對人血清白蛋白基因進(jìn)行改造和優(yōu)化。他們攻關(guān)的水稻胚乳生物反應(yīng)器技術(shù)就是利用基因工程技術(shù)改造水稻，以水稻胚乳作為“蛋白生產(chǎn)車間”來表達(dá)和生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)或者多肽的技術(shù)。整個(gè)生產(chǎn)過程包含了基因克隆、蛋白特異性高效表達(dá)，原料種植、收獲、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏，蛋白提取、純化、制劑等技術(shù)。
利用水稻胚乳特異性啟動(dòng)子、水稻偏愛密碼子優(yōu)化、蛋白質(zhì)定向存儲(chǔ)技術(shù)，根據(jù)人血清白蛋白氨基酸序列，人工合成水稻偏愛密碼子的人血清白蛋白基因全序列，將它克隆到水稻胚乳特異性的谷蛋白基因Gt13a的啟動(dòng)子和信號(hào)肽之后，構(gòu)建了水稻轉(zhuǎn)化載體pOsPMP114，然后轉(zhuǎn)化成水稻植株，通過Western-blotting檢測篩選出在水稻胚乳高效表達(dá)OsrHSA的基因工程純合品系4-114-7。
而后把培育的人血清白蛋白轉(zhuǎn)基因水稻植株移植到稻田中，在工作人員的照顧下，轉(zhuǎn)基因水稻幾個(gè)月就結(jié)出稻谷。楊代常強(qiáng)調(diào)，OsrHSA經(jīng)內(nèi)膜系統(tǒng)進(jìn)行加工和折疊成結(jié)構(gòu)正確的有活性的蛋白質(zhì)，并儲(chǔ)藏在水稻種子的蛋白體內(nèi)。
經(jīng)過多年技術(shù)改進(jìn)，蛋白表達(dá)水平提高和純化加工技術(shù)配套，最終楊代常團(tuán)隊(duì)得到的OsrHSA采取多種檢測手段與人血清白蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，確認(rèn)具有相同的一級(jí)、二級(jí)和高級(jí)結(jié)構(gòu)。
但楊代常研究啟動(dòng)后不久，反對聲不斷，甚至他自己也在輔料與藥物兩個(gè)方向之間搖擺。最后他跟自己打了個(gè)賭：按照當(dāng)時(shí)99.9%的提純技術(shù)，把OsrHSA雜質(zhì)分離出來，按照臨床10克的劑量計(jì)算，給予相當(dāng)25倍臨床劑量的雜質(zhì)，用靜脈注射的方式在大鼠身上試驗(yàn)，連續(xù)28天。觀察下來，雖然有部分大鼠出現(xiàn)不適，但沒有死亡。“起初我也很緊張，但試驗(yàn)最終證明是安全的?！睏畲；貞?，這讓他義無反顧地投入新藥研發(fā)，直奔治療用生物制品1類新藥目標(biāo)。
為市場價(jià)倒逼的成本
“與酵母發(fā)酵技術(shù)相比，我們的技術(shù)更加綠色環(huán)保。同樣生產(chǎn)1克重組HSA的能耗估算：1克重組HSA的水稻原料生產(chǎn)過程的能耗是酵母的1/28?！?/span>
“重組人血清白蛋白的研究，學(xué)界攻關(guān)37年仍未有商業(yè)化產(chǎn)品出現(xiàn)，一是臨床使用劑量高，二是市場價(jià)格相對低。”楊代常分析，使用劑量高意味著安全性風(fēng)險(xiǎn)高，因此對純度要求高。純度高意味著生產(chǎn)成本高，難以與目前市場價(jià)格較低的HSA競爭?！拔覀冏鲞^測算，每公斤稻米的血清白蛋白產(chǎn)量至少要達(dá)到3克才能真正進(jìn)入市場?！?/span>
在楊代常團(tuán)隊(duì)的研究中，確保安全控制成本始終是重中之重。用他自己的話說，“一步步來，踏實(shí)地解決高產(chǎn)量、優(yōu)化工藝問題，提升質(zhì)量，攻克檢測技術(shù)?！?/span>
“水稻種子的儲(chǔ)藏蛋白不僅種類少，而且生化性質(zhì)非常清楚?！睏畲Ｅd致勃勃地告訴記者，尤其是水稻基因組數(shù)據(jù)詳實(shí)，為設(shè)計(jì)分離純化工藝提供了良好的技術(shù)支撐，讓加工、提取和純化工藝變得更簡單。從水稻米粉中提取OsrHSA只需三步層析即陽離子、陰離子和疏水層析，就可達(dá)到醫(yī)藥級(jí)企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。如今，禾元生物可以實(shí)現(xiàn)1公斤稻米產(chǎn)出約10克血清白蛋白的世界最高產(chǎn)量水平，單批次生產(chǎn)周期能控制在36小時(shí)。
更有利于成本控制的是，水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器將通過發(fā)酵合成蛋白質(zhì)改為通過植物利用光合作用完成，“光是從商業(yè)化角度考慮，培養(yǎng)發(fā)酵不僅需要大量昂貴的發(fā)酵罐及其他配套設(shè)施，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的廢水也大大增加了生產(chǎn)成本?！彼χf。
當(dāng)然，瞄準(zhǔn)藥用級(jí)別，即便純化到99.99%，依然必須考慮雜質(zhì)檢測問題?！白鳛榕R床用途，產(chǎn)自細(xì)胞基質(zhì)的產(chǎn)品所含寄主殘留蛋白和DNA水平應(yīng)當(dāng)盡可能低?！彼麖?qiáng)調(diào)。科學(xué)家的本能讓楊代常在研究過程中實(shí)時(shí)維系相應(yīng)的專利保護(hù)，除了早年申報(bào)的“一種定量谷類生物殘留DNA的標(biāo)準(zhǔn)操作方法”，2017年禾元生物也把“檢測重組蛋白提取物中殘留雜蛋白的特異性抗體及檢測試劑”發(fā)明專利轉(zhuǎn)移到公司。
值得稱道的是，除了公司發(fā)展，楊代常還帶動(dòng)了水稻種植。據(jù)統(tǒng)計(jì)，農(nóng)民種植醫(yī)用轉(zhuǎn)基因水稻每畝增收980元，每年增加農(nóng)民收入29.4萬元，累計(jì)增加農(nóng)民收入88.2萬元。光是2013-2015年就獲得100噸左右的人血清白蛋白稻谷原料，可生產(chǎn)人血清白蛋白390~450公斤，含有人血清白蛋白的稻谷產(chǎn)值1006萬元。
“水稻系”平臺(tái)成形
“在我的計(jì)劃里，OsrHSA只是第一步。我們團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的核心是以水稻種子生物反應(yīng)器技術(shù)平臺(tái)為基礎(chǔ)，利用胚乳特異性調(diào)控元件、蛋白定向儲(chǔ)存和密碼子優(yōu)化等綜合技術(shù)，建立高效表達(dá)重組蛋白的農(nóng)業(yè)生物制藥技術(shù)體系?！?/span>
2015年，禾元生物在全國中小企業(yè)股份轉(zhuǎn)讓系統(tǒng)（新三板）掛牌。然而，由于多個(gè)新藥項(xiàng)目正處于研發(fā)的投入階段，禾元生物出現(xiàn)持續(xù)虧損。為了提升盈利能力，楊代常調(diào)整企業(yè)步調(diào)，提高技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目，擴(kuò)大快消品銷售渠道，以保障新的利潤增長點(diǎn)。禾元生物的盈利能力逐步改善，完成了多次股票發(fā)行募資。
然而，今年年中，禾元生物還是終止在新三板掛牌。回顧這段歷程，楊代常坦言，當(dāng)初掛牌，一是考慮融資，二是期望借助轉(zhuǎn)板通道，讓早期天使投資者有退出通道。
如今，楊代常不僅考慮國內(nèi)市場。禾元生物的OsrHSA數(shù)年前已成功獲得美國FDA的DMF文件號(hào)。“亞洲、非洲都有相當(dāng)大的開發(fā)潛力?！彼嘎?，目前企業(yè)正在進(jìn)行FDA的IND申報(bào)。
“人才，特別是研發(fā)人才，需要企業(yè)自己培養(yǎng)。”楊代常語氣中帶著些許無奈，這一研究方向的特殊性，決定了從其他企業(yè)挖人的可能性很低。與其他生物醫(yī)藥企業(yè)不同，禾元生物的研發(fā)團(tuán)隊(duì)需要具有分子細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)、生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等多種專業(yè)背景的復(fù)合型人才，不僅需要扎實(shí)的理論基礎(chǔ)，更要有蛋白質(zhì)和多肽表達(dá)及純化工藝研究等生物醫(yī)藥項(xiàng)目研發(fā)的豐富經(jīng)驗(yàn)。
十多年過去，楊代常不僅帶出了一批專業(yè)的研究團(tuán)隊(duì)，也引領(lǐng)禾元生物建立起利用植物表達(dá)體系進(jìn)行生物制藥的完整產(chǎn)業(yè)化體系。他們利用自家的水稻胚乳細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)平臺(tái)和蛋白質(zhì)純化平臺(tái)，開發(fā)出包括重組人血清白蛋白（OsrHSA）、重組人抗胰蛋白酶（OsrAAT）、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（OsrbFGF）、重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子（OsraFGF）、重組人乳鐵蛋白（OsrLF）、重組人胰島素樣生長因子 1(OsrIGF-1) 和重組人溶菌酶等系列產(chǎn)品。
楊代常預(yù)測，未來3年禾元生物有望推出3~4個(gè)“水稻系”新藥。也許在不久的將來，以水稻種子作為生物反應(yīng)器的技術(shù)平臺(tái)將孵化出更多產(chǎn)品，成為我國生物制藥又一新途徑，一度被視為天方夜譚的夢想終將實(shí)現(xiàn)。
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